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第4章 近代神经生物学和有关学科的发展(1)

(第一节)遗传学的发展

一、概述

1865年孟德尔经历8年的豌豆杂交试验,发现两大遗传因子传递重要定律:独立分离和自由组合。1911年摩尔根在大量果蝇研究中,论证遗传因子在染色体上,并提出连锁的遗传定律。这三大定律的发现奠定遗传学发展的基础。1902年Carrod和Baston首先运用孟德尔定律解释了一些疾病的遗传方式,开创医学遗传学。此后DNA双螺旋结构的发现,基因三联体遗传密码的确立,蛋白质合成的中心法则,以及重组DNA技术、PCR技术和人类基因组计划的成果等大量分子遗传学的概念、理论和技术渗入到医学领域,促使医学界充分认识到疾病与基因间的联系,同时也为分子水平上研究疾病发生的机理、诊断、治疗和预防提供可行的基础。

(一)疾病分子遗传学的理论基础

在经典医学遗传学基础上,运用分子生物学技术,从DNA、RNA和蛋白质三个层面上分析疾病的遗传因素,揭示基因的结构和功能的变异导致疾病发生的一门学科为疾病分子遗传学。其理论基础是基于基因科学一系列重大成果上。可包括如下几个方面:(1)1928年美国医生格里菲斯的转化试验,用灭活致病光滑型肺炎球菌和非致病粗糙型肺炎球菌混合后,注射到小鼠体内,导致小鼠死亡,这种转化因子就是DNA,首次论证遗传因子的物质基础是DNA。(2)1953年沃森和克里克基于富兰克林拍摄DNA结晶的X光衍射照片,提出DNA为双螺旋结构,由两条螺旋的长链组成,长链上有四种不同碱基的不同组合和排列,这四种碱基为A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、T(胸腺嘧啶)和C(胞嘧啶),两条链之间碱基配对固定为A一T和G一C,并有氢键连接,包含丰富的遗传信息。(3)DNA结构确立后,就必然想到DNA与蛋白质的关系。1954年物理学家加莫夫对遗传密码提出具体构想,认为由三个碱基决定一种氨基酸,这三个碱基就是氨基酸的“密码子”。克里克在这种学术思想影响下,在1957年选用大肠杆菌的T4噬菌体做实验,证实“三联体密码”的存在。继后于1966年遗传密码全部破译,64个密码子中UAA、AAG或UGA为终止密码子,AUG为起始密码子,61种密码子共代表20种氨基酸。(4)中心法则建立,DNA决定RNA结构,在特殊情况下RNA也可决定DNA的结构,蛋白质的结构是由核酸决定的,而蛋白质却不能决定核酸的结构,这就是中心法则。可见中心法则揭示基因是如何控制性状。(5)基因结构揭示,一个完整基因包括启动子、起始区、结构基因和终止区。结构基因不是连续的、而是隔断的,由外显子和内含子组成,仅外显子有编码信使RNA(mRNA)的功能。一般DNA中负链先转录成mRNA前体,然后在端加帽(加上7一甲基鸟嘌呤核苷酸),加尾(加上多聚腺苷酸,即PolyA)再剪接,即将内含子非编码序列切除,外显子序列由联接酶逐段连起,形成mRNA分子,参与蛋白质合成。(6)基因的自我复制,也就是DNA的复制,发生在细胞分裂周期的S期,以DNA分子自身一半为模板,合成新的DNA分子。充分阐明生物的性状为什么能代代遗传下去。(7)基因表达具有选择性,不同组织、不同细胞中所表达的基因内容是不一样的,这种调控包括转录前的转录水平,转录后的RNA加工水平,RNA转运水平及翻译水平,以及翻译后的mRNA降解水平。(8)人类基因组计划(HGP)于2003年4月已完成,阐明了人类基因组中所有碱基的内容和排列顺序,估计人类具有3万余基因,为今后人类疾病基因的克隆和功能研究打下基础。(9)人类基因组单体型图计划(HapMap)的实施,将为人类基因组SNP的多态性研究建立一个完整信息资料库。

(二)分子生物学实验技术的进展

近年来,分子生物学实验技术的飞跃进展,大大促进了分子遗传学的发展。这些技术进展包括如下几个方面:

1.DNA重组技术和PCR技术DNA重组技术是指在体外重新组合DNA分子,将特定的基因组合在载体(质粒)上,并使之在受体细胞中增殖和表达的遗传操作。应用这一技术能在DNA水平上直接分析人类异常基因结构,或对与限制性片段长度多态性(RFLP)连锁的遗传病的缺陷基因作间接分析。具体分析方法有三种:

(1)基因探针直接分析法若遗传病由于基因缺失或插入等原因所致,可用核素标记DNA探针直接与羊水细胞中提取的基因组DNA做分子杂交,根据杂交的百分率来判断受检基因是否存在,然后得出产前诊断。

RFLP的间接分析法有些遗传病不是基因缺失和突变,或者对疾病基因及其原始产物也不清楚,则可采用这种间接连锁分析法。例如Huntington舞蹈病(HD),用12种克隆DNA片段为探针,对HD基因作家系的连锁分析,结果发现其中G8片段的RFLP与HD基因有连锁关系,已知G8在第4号染色体上,因而把HD基因也定位于第4号染色体。

寡核苷酸探针法根据已知的疾病基因的突变结构和相应正常结构,在体外合成一段寡核苷酸片段,以这种人工合成的疾病基因和正常基因片段为探针,分别在被检的基因组DNA中直接测定缺陷基因存在与否,从而作出诊断。

PCR技术是一种体外DNA放大技术,对基因诊断、基因定位和基因病理研究很有帮助。该方法是通过耐热DNA聚合酶的作用,在体外系统中以一对寡核苷酸为引物,扩增DNA分子中两个引物所夹持的特定DNA片段,经过热变性、低温淬火和中温延伸的数十个热循环后,使DNA双链的数量达到百万倍的扩增。研究不同基因,可合成不同引物。这一方法已广泛应用于精神分裂症、Alzhimer病、苯丙酮尿症、脆性X综合征等的研究。

2.应用于基因表达研究的RT一PCR技术RT一PCR不是以基因组DNA为模板的PCR,而是以mRNA反转录成cDNA为模板,故某基因的RT一PCR产物越多,则cDNA模板越多,也就是该基因mRNA表达越多。目前主要运用实时定量PCR仪测定,并用管家基因为内对照,检测方法有两种,荧光染料SYBRGee1法和TaqMan法。前者依据SYBRGree1染料仅染上双链DNA,不染单链DNA特性,当PCR合成一条双链就被染上荧光。后者是荧光标记探针,在探针两头分别标上荧光发射基团(R)和荧光淬灭基团(Q),当R和Q同时存在于探针上,荧光发射基团不能发出荧光,经PCR合成一条双链过程中,探针上R基团被切割下来,离开Q基团,就能发射荧光。荧光越多,表示其表达越多。基因表达技术产生后,就有可能从基因功能上研究疾病的病因。

3.基因芯片基因芯片是将基因片段或寡核苷酸按矩阵高密度地合成或点在玻片或硅片等载体上,将待测样品用荧光染料标记后与基因芯片杂交。杂交信号用激光扫描仪检测,计算机软件分析结果。芯片制作上可分为原位合成法(DNAchip)和微矩阵法(DNAmicroarray)。从研究内容上可分为DNA芯片和基因表达芯片。该技术具有高效、快速和高通量的特点,对基因多态性、疾病的诊断和预测、个体化治疗和药物筛选等,都可应用。因此在疾病基因研究中将对寻找新基因和探索相关基因作用机制上发挥巨大的作用。

4.mRNA差异表达mRNA差异表达(mRNAdifferentialdisplay)是比较不同来源的mRNA表达情况,观察其差异,通过凝胶电泳分离差异片段,从而筛选特有的cDNA片段。该方法已广泛应用于生物体的发育、分化、疾病发生等方面的研究,尤其在克隆疾病的新基因上有独特的意义。

5.转基因和基因剔除技术将人工分离或修饰过的基因导入生物体基因组中,由导入基因的表达及传递性来研究导入基因的功能,称为转基因技术。当分离到一个表达基因,但尚不知其功能时,可以用同源重组的方法剔除小鼠中对应基因,做成转基因小鼠,然后观察实验动物出现异常性状或生理变化,推断未知基因的功能。

6.基因序列的测定和基因突变检测基因DNA序列的测定主要运用DNA聚合酶的双脱氧的末端终止法。目前广泛应用的是DNA测序的自动分析仪,如AB1PRISM3130型和3730型等。DNA测序不仅可了解基因的结构,而且可检测基因的突变,对分子诊断中ASO探针或PCR引物的设计极为重要,是确诊已知和未知突变基因最直接可靠的方法。基因突变检测还有其他方法,如变性高效液相色谱(DHPLC)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和恒定变性凝胶电泳(CDGE)等。序列测定和突变检测是疾病分子遗传学极其重要的技术手段。

7.遗传标记物的多态系统的形成遗传标记作为DNA序列上路标,常用于连锁分析的新基因定位和间接基因诊断。其发展分为四代:第一代是RFLP,即限制性片段长度多态性,包括DNA重组技术和PCR加上限制性内切酶处理的方法。第二代是可变数量串联重复序列(VNTR),即小卫星和微卫星DNA,最常见是(CA)n重复序列,具有高度多态性并符合孟德尔遗传方式。第三代是单核苷酸多态性(SNP),估计人类3X109碱基组成遗传信息中至少存在1000万个SNP位点,具有丰富的多态性。第四代是SNP单体型板块(haplotypeblock),单体型是指人类基因组中相邻的SNP等位位点倾向于以一个整体传递给后代,则位于一条染色体上或一个区域的一组相关联的SNP构成单体型。当一个染色体区段在历史上从未发生重组,并只存在几个单体型,称这一区段为单体型板块。其作为遗传标记的优点在于通常一个板块具3—5个常见单体型,却可覆盖全部样本80%—95%的单体型类型,即只用少数几个标签SNP,就可提供该区段内大多数的遗传多态模式,大大减少疾病关联和连锁分析中运用SNP数目。单体型板块是最新遗传标记,对多基因遗传疾病的研究将会产生不可估量的影响。

8.遗传分析的计算技术完善计算技术的完善和发展,大大促进疾病分子遗传学进步,目前在群体水平上有候选基因关联分析,即相对风险率(RR)和比值比(OR)的计算。在家系基础上连锁分析有基于单体型的单体型相对风险(HHRR)计算法、传递不平衡检验(TDT)和复等位基因的TDT计算,另外还有适合于群体或家系分析的连锁不平衡(LD)分析。

9.生物信息学的兴起和应用生物信息学(bioinformatics)是将计算机科学和数学应用于生物大分子(DNA、RNA和蛋白质)的信息的获取、加工、存储、分类、检索与分析的一门交叉学科。在基因组科学中起着重大作用,有加速发现疾病新基因、预测基因的功能和基因生理作用。目前最重要的生物信息中心之一是美国NCBI(网±止。

(三)疾病分子遗传学与精神医学

1983年Gusella等运用DNA重组技术,发现伴发精神症状的遗传性舞蹈病(huntingtonchorea)的基因定位于人类染色体4p16.3区域上。这次发现震惊全球,打破以往认为没有找到疾病的生化病理基础就不可能找到疾病基因的观点,为一直缺乏生化证据的精神疾病开拓了一条新的研究途径。到1987年George一Hrslop等以21号染色体RFLP检测阿尔茨海默病(Alzheimerdisease)病人的家系,发现存在连锁,于1987年2月在美国Science杂志上发表相关论文。6天后,英国的Nature杂志发表Egeland等的论文,发现美国宾州的OldorderAmish群体中双相情感性障碍基因定位于11号染色体上。1988年Sheringtong等采用5号染色体上DNA探针检测7个精神分裂症家系,论证5q与精神分裂症连锁,论文发表于1988年Nature杂志上。由此可见,世界上两本最顶尖的科学杂志在短短1—2年中刊登三篇精神疾病的研究报告,并宣称找到疾病的基因,这使精神医学顿时成为科学的焦点。虽然这三个研究报告除了21号染色体与阿尔茨海默病外,无法经得起科学的重复验证,但已激起全球的分子生物学技术寻找精神疾病基因的热潮,许多精神疾病研究小组与分子遗传实验室合作,寻找更多精神疾病的易感基因,如抑郁症、强迫症、多动症、孤独症及饮食失调等,发表数千篇论文。

精神医学中主要是开展候选基因关联分析,即试图寻找疾病与某些特异基因间的关联,以及基因组扫描来定位疾病在染色体上区域,为克隆新基因创造条件。因此,1987年后在精神医学中已形成一门精神疾病的分子遗传学(moleculargenetics)研究新领域。

二、儿童少年精神医学中的遗传因素

人既有生物性,又有社会性,人类整个精神活动包括思维、情感、言语、智能和行为等,均是遗传和环境相互作用的产物,儿童少年也是如此。下面对儿童精神障碍、智能低下和行为异常中的遗传因素作一讨论。

(一)儿童期发育和精神障碍

儿童期发育和精神障碍是指发生于儿童期的发育障碍和精神疾患,包括精神发育迟滞、孤独症、儿童精神分裂症和注意缺陷多动障碍等,其中有的为儿童所特有,有的成年人也可发生。对这组疾患病因中的遗传因素已有广泛研究。

1.儿童孤独症孤独症(auim)好发于婴儿期,也有的到2—3岁才出现症状,男性多见。临床表现主要为社会交往障碍、语言交往障碍和刻板重复仪式性动作等。病因至今仍不明确,经典遗传学资料来自家系、双生儿和染色体研究。

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